Paramedical Sciences and Military Health

fa طراحی و راه اندازی روش Multiplex PCR به منظور شناسایی لیشمانیا تروپیکا و لیشمانیا ماژور Design and Development of a Multiplex PCR Method for Identification of Leishmania tropica and Leishmania major مقالات کامل full articles پژوهشي Research مقدمه: لیشمانیوز جلدی یکی از معضلات مهم بهداشتی در ایران است که عمدتاً توسط دو گونه لیشمانیا ماژور (نوع روستایی/مرطوب) و لیشمانیا تروپیکا (نوع شهری/خشک) ایجاد می‌شود. تشخیص دقیق و سریع این دو گونه برای انتخاب درمان مناسب و کنترل بیماری ضروری است. روش‌های میکروسکوپی سنتی حساسیت پایینی داشته و قادر به تفکیک گونه‌ها با موفولوژی یکسان نیستند. در حالی که روش‌های مولکولی ابزاری حساس‌تر و اختصاصی‌تر محسوب می‌شوند. این مطالعه با هدف طراحی و بهینه‌سازی روش Multiplex PCR برای شناسایی همزمان مولکولی لیشمانیا ماژور و لیشمانیا تروپیکا با استفاده از اهداف ژنی اختصاصی شامل ITS2، COII و AAP3 از دو گونه‌ی مذکور انجام شد. مواد و روش‌ها: DNA ژنومی از سویه‌های استاندارد  این دو گونه با استفاده از روش فنل‑کلروفرم استخراج و کیفیت آن با نانودراپ و الکتروفورز تأیید شد. پرایمرهای اختصاصی برای ژن‌های مذکور بر اساس توالی‌های موجود در بانک ژن NCBI طراحی و با BLAST بررسی شدند. ژن GAPDH (۱۱۰جفت‌باز) به‌عنوان کنترل داخلی در نظر گرفته شد.قطعات هدف ابتدا به صورت مجزا با PCR تکثیر و سپس در وکتور pTZ57R/T  کلون شدند. پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری Top10 ترانسفورم شده و پس از تأیید با کلونی‑PCR، استخراج و به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شدند. در ادامه، واکنش‌های دوبلکس PCR (مالتیپلکس) برای هر گونه به‌صورت جداگانه بهینه‌سازی و حساسیت آزمون با تهیه رقت‌های سریالی از پلاسمیدها و محاسبه حد تشخیص)  (LOD بر اساس تعداد کپی، تعیین شد. یافته‌ها: قطعات ژنیAAP3 (468 جفت‌باز) و COII (213 جفت‌باز) برای لیشمانیا ماژور ITS2 (200 جفت‌باز) و  COII(42جفت‌باز) برای لیشمانیا تروپیکا از DNA ژنومی استخراج شده از سویه‌های استاندارد با موفقیت تکثیر شدند. اندازه باندها با محاسبات نرم‌افزاری مطابقت داشت حد تشخیص برای لیشمانیا ماژور به‌ترتیب ۱۹ کپی برای ژن AAP3 ،۴۱ کپی برای ژنCOII  و برای لیشمانیا تروپیکا به‌ترتیب ۲۸۵ کپی برای ژن ITS2 و۴۴ کپی برای ژن COII محاسبه شد. واکنش‌های مالتیپلکس بهینه‌سازی‌شده، باندهای متمایز مربوط به هر دو ژن هدف را به همراه کنترل داخلی با وضوح مناسب نشان دادند. نتیجه‌گیری: روش مالتیپلکس PCR طراحی‌شده با به‌کارگیری همزمان اهداف ژنی هسته‌ای ITS2 ، میتوکندریایی COII وعملکردیAAP3 ، روشی حساس، اختصاصی و سریع برای تشخیص افتراقی لیشمانیا ماژور و لیشمانیا تروپیکا فراهم می‌آورد. پلاسمیدهای نوترکیب تولیدشده در این مطالعه، کنترل‌های مثبت ایمن و پایداری را جایگزین کشت زنده انگل می‌نمایند. این رویکرد گامی عملی به‌سوی تولید کیت‌های تشخیص مولکولی بومی برای لیشمانیوز جلدی در مناطق اندمیک ایران محسوب می‌شود. <div style="text-align: justify;">Introduction: Cutaneous leishmaniasis is a major public health problem in Iran that mainly caused by two species:  Leishmania major (rural/moist type) and Leishmania tropica (urban/dry type). Accurate and rapid differentiation of these two species is essential for choosing appropriate treatment and controlling the disease. Traditional microscopic methods have low sensitivity and they cannot distinguish species with identical morphology, whereas molecular methods are considered more sensitive and specific tools. This study aimed to design and optimize a Multiplex PCR method for the simultaneous molecular identification of these parasites using specific genetic targets including ITS2, COII, and AAP3 from the two species. Materials and Methods: Genomic DNA was extracted from standard strains of the two species using the phenol-chloroform method and its quality was confirmed by Nanodrop spectrophotometry and gel electrophoresis. Specific primers for the aforementioned genes were designed based on sequences available in the NCBI GenBank and verified by BLAST analysis. The *GAPDH* gene (110 bp) was used as an internal control. Target fragments were initially amplified by single PCR and then cloned into the pTZ57R/T vector. Recombinant plasmids were transformed into *E. coli* Top10 competent cells, confirmed by colony-PCR, extracted, and used as positive controls. Subsequently, duplex PCR (multiplex) reactions were optimized separately for each species and the assay sensitivity was determined by preparing serial ten-fold dilutions of plasmids and calculating the limit of detection (LOD) based on copy number. Results: The  AAP3  (468 bp) and  COII  (213 bp) gene fragments for  L. major , and  ITS2  (200 bp) and  COII (442 bp) for L. tropica , were successfully amplified from genomic DNA extracted from standard strains. The band sizes matched software predictions. The LOD for L. major was 19 copies for AAP3 and 41 copies for COII; while, for L. tropica, it was 285 copies for ITS2 and 44 copies for COII.  The optimized multiplex reactions clearly resolved distinct bands corresponding to both target genes alongside the internal control with appropriate resolution. Conclusion: The designed Multiplex PCR method, employing a combination of nuclear (ITS2), mitochondrial (COII), and functional (AAP3) gene targets, provides a sensitive, specific, and rapid approach for the differential diagnosis of L.major  and L. tropica. The recombinant plasmids generated in this study offer safe and stable positive controls replacing live parasite cultures. This approach represents a practical step toward the development of indigenous molecular diagnostic kits for cutaneous leishmaniasis in endemic regions of Iran.</div> لیشمانیا ماژور, لیشمانیا تروپیکا, مالتی پلکس PCR, تشخیص مولکولی, لیشمانیوز جلدی Leishmania major, Leishmania tropica, Multiplex PCR, Molecular diagnosis, Cutaneous leishmaniasis 4 13 http://jps.ajaums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-419-1&slc_lang=fa&sid=1 Nahid Jalallou ناهید جلال لو Nahidjalallou@yahoo.com 10031947532846004982 10031947532846004982 Yes Department of Laboratory Sciences, School of Allied Medical Sciences, AJA University of Medical Sciences, Tehran, Iran. گروه علوم آزمایشگاهی، دانشکده پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی آجا، تهران، ایران. sayyed Amin Zamani سید امین زمانی amin.zamani1998@gmail.com 10031947532846004983 10031947532846004983 No Infectious Diseases Research Center, AJA University of Medical Sciences, Tehran, Iran. مرکز تحقیقات بیماری های عفونی، دانشگاه علوم پزشکی آجا، تهران، ایران. Mahdi Ghorbani مهدی قربانی mahdighorbani92@yahoo.com 10031947532846004984 10031947532846004984 No Department of Laboratory Sciences, School of Allied Medical Sciences, AJA University of Medical Sciences, Tehran, Iran. گروه علوم آزمایشگاهی، دانشکده پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی آجا، تهران، ایران. Mahmoud Vahidi محمود وحیدی mahmoud.vahidi@gmail.com 10031947532846004985 10031947532846004985 No Department of Laboratory Sciences, School of Allied Medical Sciences, AJA University of Medical Sciences, Tehran, Iran. گروه علوم آزمایشگاهی، دانشکده پیراپزشکی، دانشگاه علوم پزشکی آجا، تهران، ایران. Mehdi Shakouri مهدی شکوری shakourmehdi@gmail.com 10031947532846004986 10031947532846004986 No Infectious Diseases Research Center, AJA University of Medical Sciences, Tehran, Iran. مرکز تحقیقات بیماری های عفونی، دانشگاه علوم پزشکی آجا، تهران، ایران.