Paramedical Sciences and Military Health

fa راه‌اندازی و اعتبارسنجی اولیه یک آزمون universal یک مرحله‌ای RT-PCR با هدف‌گیری ناحیه ۵′-UTR برای تشخیص پان- انتروویروس‌ها Development and Preliminary Validation of a Universal One-Step RT-PCR Assay Targeting the 5′-UTR for Pan-Enterovirus Detection مقالات کامل full articles پژوهشي Research مقدمه: انتروویروس‌های انسانی )EVs(عامل اصلی مننژیت آسپتیک، آنسفالیت، بیماری‌های شبه‌سپسیس نوزادی و بیماری دست، پا و دهان هستند که بیش از ۱۰۰ سروتیپ آن‌ها در ۱۵ گونه طبقه‌بندی شده‌اند. تشخیص سریع و حساس برای مدیریت بالینی و کنترل شیوع حیاتی است، اما وابستگی به کیت‌های تشخیصی وارداتی در محیط‌های محدود از نظر منابع مانند ایران، چالش‌برانگیز باقی مانده است. هدف این مطالعه، طراحی، بهینه‌سازی و اعتبارسنجی اولیه یک آزمون universal  یک مرحله‌ای RT-PCR با هدف‌گیری ناحیه بسیار حفاظت‌شده ۵′-untranslated (۵′-UTR) ژنوم EV برای تشخیص طیف وسیع تمامی گونه‌های انتروویروس انسانی بود. مواد و روش‌ها: تعداد ۱۲۰ توالی ژنومی کامل EV (شامل انتروویروس A–D و راینوویروس‌های نماینده) از بانک ژن GenBank بازیابی شد. هم‌ترازی چندتوالی با استفاده از نرم‌افزار MEGA X برای شناسایی نواحی حفاظت‌شده انجام شد. پرایمرهای universal  با استفاده از نرم‌افزار Oligo7  طراحی و به صورت in silico  از طریق Primer-BLAST در برابر پایگاه داده نوکلئوتیدی NCBI اعتبارسنجی شدند. پرایمرها توسط شرکت پیشگام (تهران، ایران) سنتز شدند. آزمون با استفاده از کیت تجاری one-step RT-PCR (بیورابیت، ایران) بهینه‌سازی و با استفاده از واکسن خوراکی پولیو (سویه سابین) به عنوان کنترل مثبت اعتبارسنجی شد. اختصاصیت توسط الکتروفورز ژل آگاروز و غربالگری تقاطعی in silico  ارزیابی شد. یافته‌ها: جفت پرایمر طراحی‌شده قطعه‌ای ۱۱۰ جفت‌بازی را در ناحیه ۵′-UTR تکثیر کرد. تحلیل in silico  پوشش ۱۰۰ درصدی برای تمام انواع اصلی EV را بدون واکنش متقاطع با DNA ژنومی انسان یا پاتوژن‌های نامرتبط تأیید کرد. اعتبارسنجی آزمایشگاهی با استفاده از RNA پولیوویروس، یک باند واضح و مجزا با اندازه مورد انتظار را روی ژل آگاروز ۲ درصد نشان داد، در حالی که کنترل‌های منفی فاقد باند بودند. نتیجه‌گیری: ما یک آزمون RT-PCR universal قوی، مقرون‌به‌صرفه و بومی را گزارش می‌کنیم که قادر به تشخیص انتروویروس‌های انسانی متنوع است. این پلتفرم زیرساختی برای یک کیت تشخیصی تولید داخلی و قابل‌دسترس مناسب برای کاربردهای بالینی و سلامت عمومی در ایران و محیط‌های مشابه فراهم می‌کند. <div style="text-align: justify;">Introduction: Human enteroviruses (EVs) are a major cause of aseptic meningitis, encephalitis, neonatal sepsis-like illness, and hand-foot-mouth disease that more than 100 of their serotypes classified into 15 species within the Picornaviridae family. Rapid and sensitive detection is critical for clinical management and outbreak control; however, reliance on imported diagnostic kits remains a significant challenge in resource-limited settings such as Iran. This study aimed to design, optimize, and preliminarily validate a universal one-step reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay targeting the highly conserved 5′-untranslated region (5′-UTR) of the EV genome for broad-spectrum detection of all human EV species. Materials and Methods: A total of 120 full-length EV genomic sequences (including Enterovirus A–D and representative rhinoviruses) were retrieved from the NCBI GenBank database. Multiple sequence alignment was performed using MEGA X software to identify conserved regions. Universal primers were designed using Oligo7 software and validated in silico via Primer-BLAST against the NCBI nucleotide database. Primers were synthesized by Pishgaman Company. (Tehran, Iran). The assay was optimized using a commercial one-step RT-PCR kit (Biorabite, Iran) and it validated using RNA extracted from oral poliovirus vaccine (Sabin strain) as a positive control. Specificity was assessed by agarose gel electrophoresis and in silico cross-reactivity screening. Results: The designed primer pair amplified a 110-bp fragment within the 5′-UTR. In silico analysis confirmed 100% coverage for all major EV types without any cross-reactivity to human genomic DNA or unrelated pathogens. Experimental validation yielded a single, sharp band of the expected size on 2% agarose gel using poliovirus RNA; while, there was not any amplification in negative controls. Conclusion: We report a robust, cost-effective, and indigenous universal RT-PCR assay that is able to detect the diverse human enteroviruses. This platform provides the foundation, domestically produced diagnostic kit which is suitable for clinical and public health applications in Iran and similar resource-limited settings.</div> انتروویروس, کیت تشخیصی, RT-PCR؛ ۵′-UTR؛ پرایمر universal, تشخیص مولکولی. Enterovirus, Diagnostic kit, RT-PCR, 5′-UTR, Universal primer, Molecular detection, Iran. 14 21 http://jps.ajaums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-668-2&slc_lang=fa&sid=1 Ali Bagheri علی باقری bagherisajjad13110@gmail.com 10031947532846004987 10031947532846004987 No Golestan Hospital, Aja University of Medical Sciences, Tehran, Iran. بیمارستان گلستان، دانشگاه علوم پزشکی آجا،تهران،ایران. Hossein Dini Talatappeh حسین دینی طلاتپه h.dini1382@yahoo.com 10031947532846004988 10031947532846004988 No Infectious Diseases Research Center, AJA University of Medical Sciences, Tehran, Iran مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی، دانشگاه علوم پزشکی آجا، تهران، ایران. Negin Hosseini Rouzbahani نگین حسینی روزبهانی Signet.h313@gmail.com 10031947532846004989 10031947532846004989 No Infectious Diseases Research Center, AJA University of Medical Sciences, Tehran, Iran مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی، دانشگاه علوم پزشکی آجا، تهران، ایران Khodayar Ghorban خدایار قربان Kh.ghorban@gmail.com 10031947532846004990 10031947532846004990 No Infectious Diseases Research Center, AJA University of Medical Sciences, Tehran, Iran. مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی، دانشگاه علوم پزشکی آجا، تهران، ایران. Mohammad Gholami محمد غلامی Mohammadg19@gmail.com 10031947532846004991 10031947532846004991 Yes Infectious Diseases Research Center, AJA University of Medical Sciences, Tehran, Iran. مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی، دانشگاه علوم پزشکی آجا، تهران، ایران. Maryam Dadmanesh مریم دادمنش dr.dadmanesh@gmail.com 10031947532846004992 10031947532846004992 No Infectious Diseases Research Center, AJA University of Medical Sciences, Tehran, Iran. مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی، دانشگاه علوم پزشکی آجا، تهران، ایران. Mahtab Nourifard مهتاب نوری فرد Mahtab-noorifard@yahoo.com 10031947532846004993 10031947532846004993 No Infectious Diseases Research Center, AJA University of Medical Sciences, Tehran, Iran. مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی، دانشگاه علوم پزشکی آجا، تهران، ایران.