علوم پیراپزشکی و بهداشت نظامی

مقدمه: لیشمانیوز جلدی یکی از معضلات مهم بهداشتی در ایران است که عمدتاً توسط دو گونه لیشمانیا ماژور (نوع روستایی/مرطوب) و لیشمانیا تروپیکا (نوع شهری/خشک) ایجاد می‌شود. تشخیص دقیق و سریع این دو گونه برای انتخاب درمان مناسب و کنترل بیماری ضروری است. روش‌های میکروسکوپی سنتی حساسیت پایینی داشته و قادر به تفکیک گونه‌ها با موفولوژی یکسان نیستند. در حالی که روش‌های مولکولی ابزاری حساس‌تر و اختصاصی‌تر محسوب می‌شوند. این مطالعه با هدف طراحی و بهینه‌سازی روش Multiplex PCR برای شناسایی همزمان مولکولی لیشمانیا ماژور و لیشمانیا تروپیکا با استفاده از اهداف ژنی اختصاصی شامل ITS2، COII و AAP3 از دو گونه‌ی مذکور انجام شد.
مواد و روش‌ها: DNA ژنومی از سویه‌های استاندارد  این دو گونه با استفاده از روش فنل‑کلروفرم استخراج و کیفیت آن با نانودراپ و الکتروفورز تأیید شد. پرایمرهای اختصاصی برای ژن‌های مذکور بر اساس توالی‌های موجود در بانک ژن NCBI طراحی و با BLAST بررسی شدند. ژن GAPDH (۱۱۰جفت‌باز) به‌عنوان کنترل داخلی در نظر گرفته شد.قطعات هدف ابتدا به صورت مجزا با PCR تکثیر و سپس در وکتور pTZ57R/T  کلون شدند. پلاسمیدهای نوترکیب در باکتری Top10 ترانسفورم شده و پس از تأیید با کلونی‑PCR، استخراج و به‌عنوان کنترل مثبت استفاده شدند. در ادامه، واکنش‌های دوبلکس PCR (مالتیپلکس) برای هر گونه به‌صورت جداگانه بهینه‌سازی و حساسیت آزمون با تهیه رقت‌های سریالی از پلاسمیدها و محاسبه حد تشخیص)  (LOD بر اساس تعداد کپی، تعیین شد.
یافته‌ها: قطعات ژنیAAP3 (468 جفت‌باز) و COII (213 جفت‌باز) برای لیشمانیا ماژور ITS2 (200 جفت‌باز) و  COII(42جفت‌باز) برای لیشمانیا تروپیکا از DNA ژنومی استخراج شده از سویه‌های استاندارد با موفقیت تکثیر شدند. اندازه باندها با محاسبات نرم‌افزاری مطابقت داشت حد تشخیص برای لیشمانیا ماژور به‌ترتیب ۱۹ کپی برای ژن AAP3 ،۴۱ کپی برای ژنCOII  و برای لیشمانیا تروپیکا به‌ترتیب ۲۸۵ کپی برای ژن ITS2 و۴۴ کپی برای ژن COII محاسبه شد. واکنش‌های مالتیپلکس بهینه‌سازی‌شده، باندهای متمایز مربوط به هر دو ژن هدف را به همراه کنترل داخلی با وضوح مناسب نشان دادند.
نتیجه‌گیری: روش مالتیپلکس PCR طراحی‌شده با به‌کارگیری همزمان اهداف ژنی هسته‌ای ITS2 ، میتوکندریایی COII وعملکردیAAP3 ، روشی حساس، اختصاصی و سریع برای تشخیص افتراقی لیشمانیا ماژور و لیشمانیا تروپیکا فراهم می‌آورد. پلاسمیدهای نوترکیب تولیدشده در این مطالعه، کنترل‌های مثبت ایمن و پایداری را جایگزین کشت زنده انگل می‌نمایند. این رویکرد گامی عملی به‌سوی تولید کیت‌های تشخیص مولکولی بومی برای لیشمانیوز جلدی در مناطق اندمیک ایران محسوب می‌شود.